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DAR值是ADC药物最穷苦的质料属性，因为其决定了不错运送到肿瘤的“灵验载荷”，不错平直影响安全性和灵验性。小编之前对DAR值的每个分析法式作念了专题先容，今天对ADC药物DAR值测定的法式进行汇总先容，以期不错给环球带来匡助。一.紫外分光光度法（UV）紫外可见分光光度法是一种测定DAR值最简便便捷的法式，通过测定ADC在不同波长下的采纳值、裸抗体和药物的消光所有，不错笃定平均抗体偶联比。紫外/可见分光光度法用于定量分析的表面基础是比尔-朗伯定律，即吸光度与浓度成正比谈论：

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A为吸光度，ε为消光所有（物理常数，与物资的氨基酸构成有一定谈论），l为比色皿的旅途长度（1cm，1mm），c为浓度。当体系中有多种组分，且各组分有不同的采纳光谱，各自无侵犯，则各组分吸光度不错加和。即：

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通过已知的吸光度，已知的消光所有，通过联立方程，不错得到样品中各组分的浓度。该法式要求药物在紫外/可见光区具有发色基团；抗体和药物在其紫外/可见光谱中发达出显著的最大采纳值；药物的存在不影响ADC样品中抗体部分的光采纳特点，相似抗体亦不影响药物的光采纳特点。由于含色氨酸或络氨酸残基的卵白质往常在280nm处不雅察到最大采纳，因此要求细胞毒性药物在显贵不同于280nm动身达出最大采纳。举例，毒素在252nm处有最大采纳，抗体在280nm处有最大采纳。然则讨好子在252nm和280nm处不可有显贵采纳，兴奋以上条款的话不错将ADC看作双组份羼杂物，运用比尔-朗伯定律来分别测定抗体和药物的浓度，随后不错接洽出平均DAR值(摩尔浓度之比)。自然，淌若讨好子在上述的252nm和280nm有采纳，但与抗体和药物比较有不同的最大采纳，那么不错将ADC样品手脚三组分体系，从而定量测定DAR值。是以运用紫外/可见分光光度法测定平均DAR值，需要议论药物、讨好子、抗体的影响。

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a.毒素DM1的UV谱图，b.曲妥珠单抗的UV谱图，c.曲妥珠ADC的UV谱图运用紫外可见分光光度法测定ADC的平均DAR值的具有扩充才略如下（对于抗体、药物双组分体系）：测定药物的最大采纳波长λ(D)测定药物最大采纳波长，一般而言毒素具有疏水性，往常使用有机溶剂（如二甲基乙酰胺、甲醇）来融化，符合的浓度，不可平头。抗体的最大采纳波长一般取舍280nm即可；分别测定抗体和药物在280nm和最大采纳λ(D)处的消光所有(ε)通过抗体和药物已知的浓度（建议样品纯度要高），通过比尔-朗伯定律，分别测定抗体和药物在两个波长下的消光所有；测定ADC样品在280nm和最大采纳λ(D)处的吸光度ADC的平均DAR值接洽通过上述第2步，如故笃定了抗体和毒素在两个波长下的消光所有：

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       通过上述第3步，测定了ADC在280nm和λ(D)处的吸光值，运用比尔-朗伯定律，联立两个吸光度方程，如下：

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通过上述两个方程不错分别得到抗体和药物的浓度。

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ADC的DAR值接洽成果如下：

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备注：c为摩尔浓度综上简而言之即是测定抗体和药物在两个波长下的消光所有，然后联立ADC在两个波长下的吸光度方程，解二元二次方程。UV分析DAR值精明事项运用紫外可见分光光度法测定ADC的平均DAR值法式自然简便，且对实验室开荒条款要求不高，然则在所有这个词操作经过中如故有许多的影响成分，导致测定成果出现较大的流毒。1、使用石英比色皿，不建议使用一次性比色皿，由于一次性比色皿多为塑料材质，有限的波长界限可能不适用于某些ADC，另外保握比色皿干净。2、抗体或者药物在不同的体系中可能会有不同的消光所有，应引起爱好。3、样品的分解度也很穷苦，淌若浑浊会有较大侵犯，同期样品需要有合适的浓度，即合理的吸光度界限。4、游离毒素（小分子）的影响也要精明。5、对于高DAR值或者偶联多个小分子的ADC要具体情况要具体分析。二.反相高效液相色谱法（RP法）对于半胱氨酸讨好的偶联物，不错通过RP-HPLC测定每个偶联重链和轻链药物的加权峰面积百分比来接洽平均DAR。该法式是字据待测物资极性的大小进行分离，用该法式得到的DAR与基于药物和抗体紫外采纳的分光光度法有清雅的谈论性。通过接洽各轻、重链的峰面积百分比，结合每个峰偶联小分子药物的个数，接洽加权平均DAR值，接洽方程如下：平均偶联率接洽公式：DAR=2× (ΣLC Weighted peak area+ΣHC Weighted peak area)/100。

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RP分析DAR值精明事项1、保证样品处于复原状况，对于莫得CROSS的样品，保证唯有L和H组分。2、保证每个组分灵验分离，稀奇对于疏水性互异不大的组分。3、需要用RP-MS对每个峰进行武断，因为只是靠保留时间是无法笃定每个峰的组分，对于某些ADC，重链的极性可能比偶联一个小分子的轻链大而先被洗脱下来。三.疏水作用色谱法（HIC）疏水互相作用色谱 (HIC) 是一种卵白质分离、纯化和表征的传统本事。跟着抗体偶联药物 (ADC) 的不停发展，HIC 在ADC 表征和分析上应用越来越平常。与其他本事不同，HIC 允许卵白质在保握自然结构和活性的和气非变性条款下进行分析。HIC的法式最早由Tiselius建议，他称此本事为'卵白质盐析'。关联词，试验的 HIC 术语其后由 Hjerten 创造，他形容此经过为在固体基质上，卵白质的结合和洗脱蛋分离经过。疏水作用色谱固定相的非极性比较弱，流动相多选拔高浓度盐缓冲液进行梯度洗脱。和气的分离条款，不错幸免反相色谱中由于固定相较强的疏水性和有机流动相引起卵白质的不可逆吸维持变性，因此稀奇适用于活性物资的分离与纯化。疏水作用色谱的固定相名义为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。卵白质分子在这么的固定相和流动相中进行分派，卵白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时徐徐指责流动相的离子强度，洗脱材干增强。运用被分离组分分子名义的疏水微区、（可逆）变性后暴败露的疏水残基，或在高盐环境下露出于分子名义的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，循序用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。卵白质分子按其疏水性大小被循序洗脱出来，疏水性小的先流出。在这么的高盐水溶液中，卵白质不会失活。高浓度盐与水分子发生热烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的构成和浓度。由于各式卵白质名义氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的构成使卵白质得到分离。

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图1.HIC旨趣暗示图ADC 细胞毒剂（灵验载荷）必须穿过脂质膜以阻难 DNA 复制、卵白质合成、酶促行为或细胞分裂。要穿过膜，灵验载荷必须是亲油的，因此在性质上是疏水的。灵验载荷与抗体的讨好加多了疏水性，这种变化不错通过 HIC 检测。载荷的数量与疏水性和淹留时间成正比。况兼，疏水载荷越多，保留时间越长。通过疏水性互异分离各药物种类，并对各式类进行定量分析，是HIC分析ADC的基础。HIC不错和RP、MS等联用来分析ADC偶联情况。HIC必须与MS联用才能阐发药物与抗体偶联比（DAR），因为峰值保留时间的变化不会平直炫夸药物偶联的进程，具体的峰武断则需要对HIC图谱中的各峰进行汇聚，通过测定各组分峰的分子量来笃定。淌若每个峰的偶联情况笃定了，HIC不错很快并准确笃定每种药物的比率。因此，HIC用于质料评价和反应监测的主要法式，由于分离经过的和气性，不错用于分析具有酸不褂讪讨好的ADC。使用Tris-HCl为基础的缓冲液以线性梯度从色谱柱中洗脱卵白质，有益于不同疏水物资的分离。DAR是通过比较每个峰值的相对量和载荷的共轭进程来笃定的（通过峰面积百分比和偶联药物个数接洽加权平均DAR）。与用于ADC分析和表征的其他本事比较，HIC提供了一种独到、快速的分析法式，具有几个优点。如质谱、反相和亲水性互相作用色谱(HILIC)依赖有机溶剂手脚流动相，低或高pH值，高温等，都有可能使ADC变性。况兼针对ADC来优化这些法式从而惩处这些问题又口角常耗时的。HIC分离得到的ADC组分保握活性，可用于疗效盘问。HIC不可应用于一些亲水载荷。况兼，特地疏水的灵验载荷可能需要多数的法式开发。对于ADC的疏水性排序，HIC分析是最合适的，因为柱结合是由卵白质的疏水性驱动的，而疏水性与保留时间成正比。HIC法式的优化莫得通用的章程，针对不同的样品有不同的法式。本文所形容的法式运用常用的硫酸铵缓冲体系和丁基柱对ADC进行表征、排序和分析，是开发优化HIC法式基础。通过色谱峰面积百分比和偶联药物个数接洽加权平均DAR值，接洽公式：平均偶联率接洽公式：DAR=Σ(Weighted peak area)/100

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HIC分析DAR值精明事项1.精明硫酸铵的储存及使用灵验期，一般室温密闭条款下不错保存1个月。用时用0.2um滤膜过滤，精明不雅察是否有结晶析出。2.灵验载荷在本色上是疏水性的。疏水性越强，保握时间越长。特地疏水的灵验载荷可能会影响ADC峰的花式和洗脱，可能需要有机修饰剂来达成统统柱洗脱。对于疏水性特地强的载荷，当优化HIC法式时，应试虑非支链和较短侧链的色谱柱。3.擢升流动相缓冲液的pH值有助于擢升抗体和ADC的柱结合，而指责pH有助于卵白质的洗脱。大多数抗体的等电点在7和9之间。因此，当缓冲液的pH值接近pI时，会减少净名义电荷，并可能促进与柱的互相作用。相背，指责缓冲液的pH值，远隔pI，将加多净名义电荷，可能有助于卵白质洗脱。关联词，缓冲液pH值的变化对ADC结合和洗脱的影响是不可猜测的，取决于树脂类型、缓冲盐和样品。4.不与HIC柱结合的样品会流穿，与溶剂峰沿途洗脱，导致溶剂峰强度加多。将硫酸铵浓度擢升到2 M，并将pH值疗养到更接近ADC pI的位置是改善结合的战略。关联词，对于某些adc来说，色谱柱可能就需要具有更长的链或更多非极性基团。5.HIC一般不会出现回收率差的问题。ADC莫得注入到HIC色谱柱频频会被诬蔑为莫得从色谱柱洗脱，而试验上是由于ADC从一动手就莫得投入到色谱柱上。因此，穷苦的是要考证ADC是否吸附在色谱柱，以及仪器是否正常责任。同期，确保溶剂峰值强度不升高。当ADC不可洗脱时，可在流动相B中加入有机调动剂，如异丙醇或乙腈（15%，v/v），以促进ADC从柱基质中开释，关联词，应幸免卵白盐析或者变性。在流动相aA中不应使用有机修饰剂。这些修饰剂通过平直竞争与色谱柱的结合，并通过加多流动相的名义张力来匡助洗脱卵白，从而减少疏水互相作用。因此，向流动A中添加修饰剂会加多卵白不与色谱柱结合的可能性。淌若使用其他色谱柱，率先确保未偶联的抗体结并吞在梯度25%畴前被洗脱。6.经典共轭ADC的一般法式往常无法达成峰基线分离;而对于更均匀的位点特异性共轭ADC，则得到了较好的成果，分别见图3和图4。为了达到清雅的峰分离，需要对法式进行优化。优化需要议论流速、梯度、HIC柱和流动相构成。由于分子的复杂性，优化HIC法式往常与未偶联ADC有一定互异。7.峰的分离是数据分析中需要查验的另一个穷苦参数。预期峰的数量应该反应在图谱中。枯竭峰值或加多峰值对DAR接洽都是有影响的。因此，质谱分析需要杰出偶联药物的数量和每个峰的载药量，以笃定峰分离法式的充分性。当议论到这极少时，不错通过蔓延梯度来改善峰分离。8.梯度优化不错改善峰的花式和峰的分离，以擢升数据的准确性。一般来说，加多梯度的长度不错改善峰的分离和花式。由于ADC的复杂性，梯度优化参数必须通过实验笃定。梯度取舍依赖于流动相、流速和色谱柱。使用硫酸铵缓冲液的洗脱梯度较短，但使用其他缓冲盐时必须蔓延梯度。9.丁基树脂是HIC柱最平常使用的树脂，由于树脂链长，具有中等的结合倾向。典型的HIC柱具有线性的烷烃链或简便的芳醇基团，并不错通过分支进一步修饰。不同厂家的丁基色谱柱可能会有不同的互异，从而影响结合、峰分离和洗脱。使器用有更长或更多支链的色谱柱不错增强样品的结合和保留。树脂的结合材干取决于链的长度，链越短，结合材干越弱，反之也是。一些常见的树脂，按链长从低到高和结合材干的规矩为:甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。10.样品纯度是HIC分析凯旋的要津。所有样本都应过滤，去除游离载荷和团员，以确保赢得准确的数据。对于小限制的偶联物，ADC不错使用缓冲交换柱进行纯化;对于大限制的制剂，ADC不错使用陶粒羟基磷灰石色谱或切向流过滤进行纯化，以去除或最小化目田载荷稠浊物和王人集物。目田载荷，稀奇是那些特地疏水的载荷，也会与HIC柱结合，这可能会使数据解释复杂化(如图6所示)。卵白质王人集物频频更疏水，并将与单体分离，从而形成单独的峰。由于峰的识别对于准确的数据解释至关穷苦，是以应该尽一切致力摒除由于王人集物和游离药物等东谈主为成分酿成的峰。11.进样体积请勿特出100 μL，不然ADC可能无法与柱结合。该法式旨在最小化样品制备。淌若进样体积大，则样品缓冲界面的盐浓渡过低，导致ADC不会被柱吸附。为了克服这个问题，不错在样品中加入体积比不特出50%的流动相A。同期要幸免流动相A平直加入到样品中可能引起卵白千里淀。12.精明溶剂峰的保留时间，淌若保留时间有漂移，可能是盐的千里积堵塞管路，需清洗开荒。纪录柱装置后的运行姿色背压。背压的加多会影响成果。在样品运行前后，用50毫升水冲洗HPLC，祛除仪器上的残留盐，以驻守堵塞或限定流动。铵盐可能在仪器内千里淀，导致样品结合和回收率差、保留时间偏移、样品洗脱不统统，影响法式优化、数据解释和故障排除。13.柱温对样品的吸维持洗脱影响很小，但会影响峰型。柱温最佳不要特出30℃，不然会使卵白变性。柱温优化应该放在终末。14.在A280nm处监测洗脱峰时，硫酸铵缓冲液通过梯度洗脱会导致基线细微偏移。关联词，不错使用使信号与噪声之比最大化的任何采纳波长。在某些情况下，附加灵验载荷后，不错在一个特有的波长下辞别共轭峰与非共轭峰。举例，在330 nm下对吡咯苯并二氮杂卓偶联ADC进行检测，只可检测到偶联的峰。15.峰的积分是DAR接洽的必要条款，清雅的峰形对接洽精度有穷苦意旨。峰值花式主要受色谱柱和梯度的影响。淌若峰太宽或太窄，峰的准确积分会受到影响。蔓延梯度不错改善窄峰的花式，裁减梯度有助于宽峰的花式。唯有为了保证积分精度，才能改变峰的花式。改变流动相构成，举例，使用乙酸铵缓冲液或不同的色谱柱，可能会改善峰型。16.具有非疏水或亲水载荷的adc可能不具有典型的洗脱峰。这些ADC能以较短的保留时间洗脱或与裸抗共洗脱，淌若ADC和未偶联抗体保留时间疏导，则不可使用HIC进行分析和表征。17.共轭位点影响峰的花式和洗脱峰的数量。迄今为止，所有已批准的ADC均使用赖氨酸或搭钮半胱氨酸的立时偶联法式。这种偶联法式产生多个峰，对应于药物负载的进程，分析起来可能很复杂(图2)。另外，临床检修中的几个ADC是位点特异性偶联到一个或多个工程位点。这些位点特异性ADC一般都是均匀的，用HIC分析时产生一个单峰，比立时共轭的adc疏水性更低。与立时偶联的ADC比较，一些位点特异性的偶联位点不错最大限制地减少负载的露出，从而减少疏水性和保留时间。18.纪录运行溶剂峰值强度。溶剂峰强度的加多标明样品结合不统统。溶剂峰强度对排除ADC结合问题特地有用。在法式优化经过中，当测试柱或流动相时，追踪溶剂峰值强度口角常有用的。19.在造反体和ADC进行疏水性排序时，应具有合适大的样品浓度虚心冲液。由于疏水性和脱靶毒性之间的谈论，基于疏水性的药物候选排序是穷苦的。图7炫夸了针对疏导肿瘤特异性抗原的6个抗体的HIC分析，这些抗体是ADC候选药物。在这种情况下，mAb-A疏水性最小。在对ADC进行疏水性名次分析时，抗体、偶联位点、偶联法式和负载都会影响保留时间。四.液质联用法（LC-MS ）非变性质谱分析如故证明了其用于抗体-药物偶联物(ADC)的定量和定性分析的高大上风，稀奇是当ADC亚基触及非共价互相作用时(举例：半胱氨酸偶联ADC)。非变性质谱的应用平常，如抗体-药物偶联物（Antibody-drug conjugates， ADCs）中药物的药物抗体比率（drug to antibody ratio， DAR）测定：ADCs药物字据抗体偶联的位点分为赖氨酸和半胱氨酸偶联的ADCs两类药物，对于赖氨酸偶联药物，测定常基于传统RPLC/MS本事平台，卵白质需要在变性的条款下进行DAR测定，然则这种变性的条款会酿成半胱氨酸偶联的ADCs抗体轻重链分离，因此，半胱氨酸偶联的ADCs检测不错借助非变性质谱的技巧。液质联用法通过分子量大小进行分析，通过偶联不同数量小分子药物资量数的加多辨别出偶联不同数量小分子药物的抗体的峰，通过各峰面积百分比和偶联药物个数接洽加权平均DAR值，接洽公式：DAR=加权峰面积之和/100。液质联用不仅不错接洽DAR值，还梗概给出讨好不同数量小分子药物的散布信息，以及反应经过副居品空linker的散布等情况。

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五.其他法式抗体偶联药物DAR值测定还有一些其他法式，比如：亲水作用色谱法（HILIC）、Cathepsin B酶切法等。亲水作用色谱法（HILIC）该法式是字据待测物资亲水性的不同进行分离，是抗体N-糖糖谱测定最常用的法式。HILIC分析ADC的DAR值前处理同反相高效液相色谱法，ADC选拔IdeS酶切后复原，得到Fc/2、轻链L0，偶联一个小分子药物的轻链L1、Fd、偶联1-3个小分子药物的Fd1-Fd3，选拔亲水作用色谱法进行分析。

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艳母在线观看通过接洽各峰面积百分比，结合每个峰偶联小分子药物的个数，接洽加权平均DAR值，接洽公式如下：平均偶联率接洽公式：DAR=2× (ΣLC Weighted peak area+ΣFd Weighted peak area)/100。亲水作用色谱法不仅能对ADC的DAR值和药物散布情况进行分析，同期还能分析N-糖的散布情况，各峰的武断包摄保举先用LC-MS进行峰武断。该法式与反相高效液相色谱法互相印证。Cathepsin B酶切法（Cathepsin B）Cathepsin B是溶酶体内半胱氨酸卵白水解酶，其催化作用由Cys、His 达成，易被巯基试剂阻难，又称巯基酶，属于木瓜卵白酶眷属。Cathepsin B酶切法率先将ADC用IdeS酶在搭钮区下方切开，然后复原，使小分子药物充分露出。这种预处理不错让Cathepsin B不受限定地投入裂解位点，确保充分酶切。通过反相高效液相色谱将裂解后的药物从卵白组分等分离出来，并字据紫外采纳测定其浓度。

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以上即是抗体偶联药物DAR值测定常用的法式，还有一些不常用的法式，比如有用CE测DAR值的等等。跟着分析本事的发展，DAR值测定的法式也会不停更新，然则根底点唯有一个即是保证不同的组分不错灵验分离，这么才能精准接洽DAR值。对于上述ADC的DAR值测定法式，每个法式都不是孑然的，应该用多种法式去分析DAR值，不同法式互相佐证，才能对DAR值分析有更深的王人集和得到愈加准确的成果。参考文件1.Oscar Hernandez-Alba ，Analysis of ADCs by Native Mass Spectrometry ，197-211.2.Chen J， Yin S， Wu YJ， Ouyang J (2013) Development of a native nanoelectrospray mass spectrometry method for determination of the drug-to-antibody ratio of antibody-drug conjugates. Anal Chem 85(3):1699–1704 .3. Ryan Fleming（2020）ADC Analysis by Hydrophobic Interaction Chromatography.Methods Mol Biol 2078:147-1614. Cusumano A， Guillarme D， Beck A et al (2016) Practical method development for the separation of monoclonal antibodies and antibodydrug-conjugate species in hydrophobic interaction chromatography， part 2: optimization ofthe phase system. J Pharm Biomed Anal 121:161–1735. Fekete S， Veuthey JL， Beck A et al (2016)Hydrophobic interaction chromatography for the characterization of monoclonal antibodies and related products. J Pharm Biomed Anal 130:3–186. Alley SC， Anderson KE (2013) Analytical and bioanalytical technologies for characterizing antibody–drug conjugates. Curr Opin Chem Biol 17(3):406–4117.D'Atri V， Fekete S， Stoll D， et al. Characterization of an antibody-drug conjugate by hydrophilic interaction chromatography coupled to mass spectrometry. J Chromatogr B 2018， 1018: 37-41.8.Adamo M， Guoyong Sun GY， Qiu DF， et al. Drug-to-antibody determination for an antibody-drug-conjugate utilizing cathepsin B digestion coupled with reversed-phase high-pressure liquid chromatography analysis. J Chromatogr A， 2017， 1481: 44-52.公众号已竖立ADC质料盘问群，扫描下方小编二维码加入，入群请奉告姓名、责任单元及职务。对于ADC质料盘问的问题，环球不错随时私信小编，咱们沿途交流、学习、向上。↑ 小编微信 本站仅提供存储就业，所有内容均由用户发布，如发现存害或侵权内容，请点击举报。